蛋白质组分析技术研究进展＊

刘立国，陆慧君，贺文琦，邓旭明^*

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062)

摘　要：蛋白质组学研究的核心技术是蛋白质成分的分离和鉴定。通过鉴定蛋白质组结构、功能及其各蛋白质间的相互作用关系， 最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究，其表达模式的鉴定技术主要有以质谱为核心的技术、蛋白质微测序和氨基酸组成分析等。了解肽和蛋白质的序列对理解其功能具有重要意义，测定其序列也是当前生命科学研究中的重要内容之一。质谱作为高灵敏度的测定分子结构的仪器，其高灵敏度、广泛的适用性及快速性等特性使它具有很大潜力，发展成为辅助传统测序方法的新方法，并得到了广泛的关注。

关键词：蛋白质组；蛋白质鉴定；分析技术 

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，并不能全面代表蛋白质表达水平。试验证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质­蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。

蛋白质组(proteome) 最早是由澳大利亚Wilkins 于1994 首先提出的，并见于1995 年7 月的《Electrophoresis》杂志上。蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科，是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律 ^[1­2]。与基因组学相比，蛋白质组学是从蛋白质的整体水平，更深入、更接近生命本质的层次去发现和探讨生命活动的规律及其重要生理病理现象的本质^[3­4]。蛋白质组学的特点是采用高分辨率的蛋白质分离手段结合高通量的蛋白质鉴定分析技术，全景式地研究在各种特定情况下的蛋白质表达谱。其研究内容主要包括：①蛋白质结构及其转录后修饰的微特征鉴定；②比较蛋白质组学，通过蛋白质水平的比较，显示其在疾病研究中的应用潜能；③蛋白质之间的相互作用。

    蛋白质组学研究主要依赖于蛋白质组分离技术、蛋白质组鉴定技术及利用生物信息学进行蛋白质结构和功能预测。整个研究过程包括样品处理、蛋白质的分离、蛋白质丰度分析、蛋白质鉴定等步骤。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低，在此只归纳蛋白质组分析鉴定技术。

1　蛋白质组表达模式研究技术

1.1　二维凝胶电泳技术

二维凝胶电泳技术由Farrell O N等^[5]首先提出，原理是第一维基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二维则按分子质量的不同用SDS­PAGE分离。这种基于电荷分离(等电点，pI)和分子质量大小分离(分子质量，Mr)的正交组合，使得样品蛋白质点分布于整个二维凝胶图谱上。

二维电泳中的第一相等电聚焦(IEF)电泳，是根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子，根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或净电荷为零。等电点(pI)是蛋白质所带净电荷为零时的pH，周围pH小于其pI时，蛋白质带正电荷，大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF对蛋白质处于一个pH梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向其净电荷为零的点，净电荷为正的蛋白将移向负极，净电荷为负的将移向正极，直至到达其等电点，如果蛋白质在其等电点附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应，它可以在等电点附近浓集蛋白，从而分离电荷差别极微的蛋白。

根据第一相等电聚焦条件和方式的不同，可将二维凝胶电泳分为3种系统：①ISO­DALT(平衡pH梯度电泳)系统，在该系统中等电聚集在聚丙烯酰胺凝胶中进行，载体两性电解质(carrier ampholute)在外加电场作用下形成pH梯度。由于合成的载体两性电解质的特性，分子相对较小，难以固定在IEF胶内，在电泳过程中由于电渗流而导致阴极漂移，pH梯度在碱性不稳定，重复性不易掌握和上样品量低，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质。优点是电泳设备要求不高，一般实验室均可开展工作。如果条件经优化后也可达到较高的分辨率和较好的重复性。②NEPHGE(非平衡pH梯度电泳)系统，是一种用于分离碱性蛋白质的方法，蛋白质在等电聚焦场达到平衡前结束电泳，第一相的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。这种方法是在快速形成的pH梯度中根据蛋白质的移动能力进行分离。③IPG­DALT(固定pH梯度电泳)系统，此系统的第一相电泳是采用1982年在Immobilise试剂的基础上开发的固相pH梯度(immobilized pH gradient， IPG)技术。该技术的pH梯度的形成依赖于不同的pK值的丙烯酰胺的衍生物，这是一种非两性的弱酸和弱碱，在凝胶聚合过程中，能与聚合的丙烯酰胺共价结合。因此，IPG的pH梯度是稳定的，不依赖于外加电场。基本上克服了ISO­DALT的主要缺点。目前在蛋白质组研究中主要应用的是Gorg等建立的IPG­DALT系统，第一相电泳使用的是丙烯酰胺和不同pH梯度的丙烯酰胺衍生物(Immobilises)共聚合而形成的具有固定pH梯度的凝胶(IPG)，它具有分辨率高、上样品量大、重复性好的优点。

1.2　多维色谱技术

应用于蛋白质组研究中的多维色谱(Multidimensional liquid Chromatography， MDLC)技术，又称为多维蛋白质分析技术(multidimensional analysis of proteins identification technology， MUDPIT)，此概念最初是由Yates等引入并进一步发展的，该技术以其特有的多维全自动纯化特点成为无需2D­Gel 技术的另一蛋白质组样品分离途径。它是根据分离机理不同的色谱柱通过串联能够极大地提高峰容量的特点来设置的；正交的高效液相色谱分离方法与二维凝胶电泳分离原理相似，都是根据蛋白质固有的理化性质不同进行分离，如等电点、分子质量、疏水性等。多维色谱通过独有的液相色谱分离工作站，使用包括离子交换色谱(ion exchange chromatography， IEX)、等电点聚焦(isoelectric focusing， IEF)，反向色谱(reversed­phase chromatography， RPC)等手段与质谱系统，包括MALDI­TOF、ESI、Q­TOF等技术的完美结合，对一些2D无法解决的蛋白鉴定，如低丰度、碱性和极酸性蛋白、膜蛋白、大分子质量和小分子质量蛋白等，将之分离鉴定，将蛋白组研究引向更加深入的层次。目前，研究所采用的多维色谱­质谱分离鉴定方法主要包括：①排阻色谱­反相色谱(SEC­RPLC)­质谱联用，该方法先根据蛋白质的分子大小以及蛋白质的疏水性来分离，然后用质谱在线检测；②离子交换色谱­反相色谱(IEX­RPLC)­质谱联用，该方法先后利用蛋白质的等电点和疏水性来分离，质谱在线检测；③液相等电聚焦­反相色谱(IEF­RPLC)­质谱联用，该方法第一相和2DE的第一相原理一样，根据蛋白质的等电点不同而实现分离，但是其上样量则大大的提高了；④色谱聚焦­反相色谱(CF­RPLC)­质谱联用，通过一系列不同pH的缓冲液来洗脱不同pI的蛋白质；色谱聚焦同样也有离子交换的优点，并且不需要脱盐这个步骤；通过控制洗脱液的pH，相应pI的蛋白质洗脱下来进入反相柱后根据其不同的疏水性而得到进一步的分离，并用质谱在线检测；⑤亲和色谱­反相液相色谱(AC­RPLC)­质谱联用，这是一种用来分析一些特殊肽片段，比如磷酸化肽片段的方法，它首先通过亲和色谱捕获目的肽片段，然后根据蛋白质的疏水性用反相液相色谱分离，质谱鉴定，这种方法对研究蛋白质翻译后修饰，特别是磷酸化蛋白质组的研究具有重要意义。

1.3　与质谱相关的技术

1.3.1　离子化技术

1.3.1.1　 电喷离子化技术(Electrospray Ionization，ESI) 　电喷离子化是在大气压条件下进行的，用正电压和负电压时都可以产生电喷雾，分别形成气相的阳离子和阴离子。在肽片段的电喷离子化过程中，含有肽的酸性溶液通过毛细管电喷针，对电喷针施以高伏正电压(＋2 kV～＋5 kV)，质谱检测器入口处的电压相对于电喷针的电压很低相当于反向电极，这样就在电喷针和质谱检测器入口之间形成一个高压电场。当含肽的酸性溶液流至电喷针的出口时，由于液体表面张力和电场力的作用，就会在电喷针出口处形成Taylor小液锥，在小液锥的尖端会喷射出许多带有正电荷的小液滴。在电喷针和质谱检测器入口之间的大气压界面加热并应用中性干燥气体(氮气)，由于液体蒸发，带电小液滴的体积逐渐缩小，电荷密度不断加大，当电荷之间的静电斥力过液体的表面张力时，小液滴就会爆裂形成更小的带电小液滴，此过程反复进行最后就会形成带会形成带正电荷的气相离子。持续稳定的液流通过电喷离子化会产生连续的离子束，因此电喷离子化非常适合与高效液相色谱技术进行整合。当溶剂流速相对较高时100 μL/min～1 mL/min，需要氮气辅助溶剂的蒸发。低流速时单独应用高电势便可进行电喷离子化。流速小于100 nL/min时，即为纳喷(Nanoelectrospray)，低流速会产生更小的带电小液滴，这样就会有大量的电喷雾进入质谱检测器的入口，由于电喷雾的浓度敏感特性，与高流速相比低流速时需要的样品量更少，检测的灵敏度明显提高。电喷雾的另一个特点是能够产生多价电荷的离子，因此使m/z范围有限的质谱检测器可以检测高分子质量的分子，而且多电荷的肽也易于用碰撞诱导碎裂(collision induced dissociation， CID)使它们的肽键断裂，从而产生丰富的序列信息。此外，ESI是一种非常“温和”的软离子化技术，可以使非共价结合的生物大分子复合物完整的被离子化，这就使它便于研究蛋白质­蛋白质相互作用、蛋白质­药物相互作用。ESI的这些特性使它在蛋白质组学研究中得以广泛应用。尽管ESI是一种强有力的离子化技术，但它也存在两个明显的缺点：①ESI的流动性意味着样品在被不断的消耗，但还没有质谱检测器能连续不断的分析离子，这就造成了样品的浪费。该缺点正在通过不断提高质谱的扫描速度及发展脉冲式ESI源逐步克服；②当分析复杂的混合样品时，样品中高浓度的分析物会抑制低浓度分析物的离子化。

1.3.1.2　基质辅助激光解离/离子化技术(matrix­assisted laser desorption/ ionization， MALDI)　与ESI不同，MALDI是用激光的能量而不是用电能使生物分子离子化。肽分子或蛋白质分子被包埋在能够吸收特定波长激光(通常为337 nm)的基质中与其共结晶。它们被置于真空系统中，当用脉冲激光轰击样品时，基质会吸收激光提供的能量，能量的释放引起基质和分析物迅速热膨胀并成为气相，经基质与分析物之间的能量传递机制使分析物离子化^[6]。最近的技术革新已能使MALDI离子源在大气压的条件下进行操作，这就使MALDI和ESI可以在相同的仪器上交替使用^[7]。MALDI主要产生带单电荷的分子离子。对于分子质量小于5 ku的肽或多肽，最常用的基质是a­cyano­4­hydroxycinaminic acid；对于蛋白质最常用的基质是3,5­dimethoxy­4­hydroxy­cinnamic acid或sinapinic acid。MALDI不象ESI那样对样品中的盐很敏感。由于激光的发射是间断的，离子的形成也是间断的，如果将质谱检测器的质量分析调整到与离子形成同步，则样品的浪费就会被降至最低程度，所以MALDI的敏感性非常高。尽管MALDI具有诸多优点，但它也有其固有缺点。MALDI的脉冲特性使其具有很高的敏感性，但也使其难以与某些质谱检测器整合。此外，基质的出现既有利于分析物的离子化，同时也会产生大量m/z<500的化学噪音，因此低分子质量样品用MALDI较难检测。目前发展的在硅基质上进行解离/离子化(DIOS)技术可以得到与MALDI相似的结果，但在低m/z范围却不会产生化学背景噪音^[8­9]。

1.3.2　质量分析器　当被离子化的离子离开离子源时，它们会通过质谱检测器的入口进入质量分析器。质量分析器根据这些离子的m/z对它们进行分离。目前用于蛋白质组学研究的质量分析器包括以下几种类型。

1.3.2.1　四极杆分析器(Quadrupole) 　四极杆质量分析器是由4根金属棒组成，通过对它们施以正交流电压(Radiofrequency voltage， RF)和直流电压(Direct current voltage， DC)就会形成一个动态电场，离子通过其中时会产生振动，只有特定m/z的离子才能通过四极杆分析器，从而完成对离子的质量分离^[10]。

1.3.2.2　离子阱质量分析器(Ion Trap)　离子阱质量分析器与四极杆质量分析器相似，通过施以RF电压使离子产生振动。之所以称之为“离子阱”，是因为施加的电场开始时会锁住所有m/z的离子。四极杆产生的电场是二维的(即在x和y方向)，离子以垂直于电场的方向运动(即沿着z方向)，而离子阱的电场是三维的，因此离子可以被锁定在电场中。通过m/z依赖的方式调整RF电压，使锁定离子的振幅增加，并以m/z递增的方式射出离子阱进入检测器。这种操作方式被成为“质量选择性不稳定”，除了选定m/z的离子外其它离子都被锁定在离子阱的电场中。离子阱系统的一个重要特点就是具有极好的灵敏度。在离子阱系统中离子源产生的离子通过质量分析器到达检测器的效率很高，而且对产生离子的利用率很高，这两方面的原因使离子阱具有很好的灵敏度^[11­12]。

1.3.2.3　飞行时间质量分析器(Time of flight， TOF)　TOF是基于离子的飞行速度对它们进行质量分离。从理论上讲，样品分子在离子源处是在相同的时间和地点被离子化，通过施加一定的电压(通常为＋20 kV～＋30 kV)离子获得一定的动能加速进入TOF飘移管。当所有带相同电荷的离子获得相同的动能加速后，低m/z离子的速度比高m/z离子的速度快，离子飞行速度与其m/z的平方根成反比，它们飞行过一段固定的距离后撞击检测器，通过它们到达检测器的时间就可以计算出它们的m/z。

1.3.2.4　傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(Fourier transform ion cyclotron resonance，FT­ICR)　FT­ICR用磁场确定离子的m/z，与离子阱相似FT­ICR也将离子锁定在一个三维空间中。在FT­ICR中离子的动能很低，在低动能时离子不能穿透磁场，在一个恒定的磁场中，离子以一定的回旋加速频率围绕磁场振荡，离子的回旋加速频率与其m/z成反比，因此可以根据离子的回旋加速频率计算其m/z。FT­ICR具有极高的质量分辨率及质量准确性，但价格也相对昂贵。

1.3.2.5　串联质谱 (Tandem mass spectrometer)　软离子化技术对于质谱用于检测生物样品具有革命性影响，通过软离子化技术产生的分子离子很完整，很少或完全没有碎裂，因此无法直接获取分子的结构信息，借助串联质谱(MS/MS)的方法可以诱导分子离子碎裂从而获得其结构信息。MS/MS由先后发生的一系列事件组成，简而言之可分为3个阶段。在分析的第1阶段，通过质量选择选定母离子(Parent ion or Precursor ion)；第2阶段，通过各种碎裂方法使选定的母离子碎裂，碎裂的方法包括碰撞诱导碎裂(与氦气分子碰撞，CID)、表面碰撞诱导碎裂(Surface­induced dissociation， SID)、与光子相互作用而产生的光裂解(Photodissociation)、热/黑体红外辐射碎裂(Thermal/black body infrared radiative dissociation， BIRD)及电子捕捉碎裂(Electron­capture dissociation， ECD)，当前应用最广泛的碎裂方法是CID；第3阶段，对母离子碎裂产生的产物离子(Product ions or fragment ions)进行质量分析。在此基础上还可以通过多阶段的串联质谱进行MSⁿ分析。

当前应用于蛋白质组学研究的串联质谱根据串联机制的不同可以分为两大类，即空间串联质谱(Tandem­in­space mass spectrometers)和时间串联质谱(Tandem­in­time mass spectrometers)。空间串联质谱包括三重四极杆质谱(Triple quadrupole)、四极杆飞行时间质谱(Quadrupole time of flight )、串联飞行时间质谱(Time of flight/time of flight， TOF/TOF)。时间串联质谱包括四极杆离子阱质谱(Quadrupole ion trap)和傅立叶变换离子回旋共振质谱(Fourier transform ion cyclotron resonance)等。

1.4　氨基酸组成分析

指利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该法可应用放射标记的氨基酸来测定蛋白质的氨基酸组分，或将蛋白质转PVDF膜，在155 ℃酸性水解，让氨基酸自动衍生后，经色谱分离，获得的数据软件进行数据库查询，依据代表两组分间数目差异的分数对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”蛋白质的可信度较大。该法的缺点是速度较慢，所需蛋白质或肽的量较大，酸性水解不彻底或部分降解时可产生氨基酸变异。

2　蛋白质组功能模式研究技术

2.1　蛋白质芯片质谱技术

蛋白质芯片质谱技术是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，它的出现得益于微制作技术以及表面化学等技术的发展。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。蛋白质芯片是指在硅物质如玻璃、硅片等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，通过如抗原与抗体、受体与配体、酶与底物专一性结合等各种相互作用可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析^[13­15]。目前，蛋白质芯片大致可分为生物化学型芯片、化学型芯片两种类型，其中生物化学型芯片与DNA芯片相似，即根据研究目的不同，将蛋白质、多肽等具有生物活性的分子，如抗体、抗原、受体、酶等作为探针固定于玻璃，PVDF膜、硝酸纤维膜等固相介质表面，利用蛋白质相互作用达到特异性地捕获样品中靶蛋白的目的。而化学型芯片则与传统色谱相似，依据反向层析、离子交换层析、亲和层析等原理，将色谱相关介质作为探针结合于固相支持物表面，使其形成一个具有不同特性的物理化学层析表面，通过色谱介质的疏水性、静电力、亲和性等不同性质结合样品中的蛋白质。上述两种芯片技术都具有快速、操作简便、样品用量少、对多样品平行检测等特点。对于复杂的样品，包括的生物体液，经过简单的预处理就可直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，不同芯片可以选择性地捕获不同特性的蛋白质，包括疏水蛋白、金属结合蛋白等，经不同程序的洗脱后，最后用质谱仪鉴定，一个样品只需几分钟的时间。这种蛋白质芯片质谱技术最本质的优点是通过表面选择性吸附大大降低了蛋白质的复杂性，同时又能对多样品平行分析，从而把每个蛋白放在一个具有相互参照价值的背景里。另外，各种芯片所收集的蛋白具有不同的等电点、金属结合能力以及疏水特性，这使研究者在分子质量之外得到了额外的信息。通过使用高通量的MALDI­TOF检测，能够快速可靠地识别蛋白质，而不必计较它们的形式、溶解度和使用的分离技术^[16­17]。Petricoin E等^[18]用蛋白质芯片技术从卵巢癌病人的血清中筛选出了5个标志蛋白，对临床样品的检测灵敏度达100%。Haab B B等^[19]则评价了用蛋白质芯片技术在复杂的溶液中对低浓度存在的特异性蛋白和抗体进行平行检测和定量的极强能力。而Neuhoff N等利用SELDI/MS分析了膜血管球性肾炎(membranous glomerulone­ phritis)病人与正常人的尿液，并与毛细管电泳/质谱技术进行了比较研究，表明SELDI/MS使用简便，用量极少，对于临床样品的检测非常实用^[20]。

近几年来，INVITROGEN公司推出的GATEWAY系统作为一种高通量基因克隆和表达方法已广泛应用，高通量表达为蛋白芯片制备的提供了简捷迅速的方法，Marsischky G等^[21]从商业化基因组克隆分析了应用GATEWAY系统的重要性。

2.2　生物传感芯片质谱

生物传感芯片质谱是定性和定量检测蛋白质间相互作用并对其进行鉴定的简便而快捷的方法。它是以表面等离子激原共振(SPR)为基础的生物分子相互作用分析技术(BIA)与MALDI­TOF质谱技术有机结合而形成的新型技术，核心是生物传感芯片，其以玻璃作为支持物，上面结合有羧甲基葡聚糖聚合物，通过化学修饰可将特定蛋白质(肽)固定在葡聚糖聚合物上形成传感片，待测蛋白质或肽溶液通过微射流卡盘流过该固相载体时，与固相蛋白质(肽)发生相互作用的蛋白质(肽)被滞留在聚合物的表面上，而芯片表面蛋白质含量增加导致入射光的折射率改变，使其表面等离子激原共振光的共振角发生改变(该变化与表面蛋白的含量呈线性关系)，通过SPR­BIA系统监测。SPR是非破坏性的，在芯片上结合蛋白质(肽)的分子质量范围一般在0.2 ku～50 ku，与质谱的有效分析范围相符，故可将SPR­BIA分析后滞留在芯片上的蛋白质(肽)通过与基质结合从固相蛋白质(肽)的相互作用中解离出来，直接进行MALDI­TOF质谱分析，鉴定被测蛋白质。该法的优点是快速、灵敏、精确、特异，检测水平可达飞摩尔甚至亚飞摩尔；能直接检测复杂混合物中蛋白质间相互作用；可进行通量分析，对多种分析物进行测定。

2.3　酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是目前研究蛋白质组中蛋白质间相互作用的一个重要手段，其基本思路是只有靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，其中的诱饵蛋白结合于报道基因的启动子才能启动报告基因在酵母细胞内的表达，通过检测报告基因表达产物判别作为“诱饵”和“靶蛋白”的两个蛋白间是否存在相互作用。该技术的发展与创新，在蛋白质间相互作用的研究、新蛋白质筛选、蛋白质功能研究等诸多方面发挥着重要作用。为便于分析蛋白质的的相互作用，Kim J  Y等^[22]设计一种称为一加二双杂交系统，此系统在同一细胞以双报告操作系统改变了标准的酵母双杂交系统。

2.4　噬菌体展示技术

主要采用抗体基因文库的构建及随机多肽基因文库的构建和筛选，其优点是可直接得到基因，高选择性的筛选复杂混合物，在筛选过程中通过改变适当的条件可以直接评价相互结合的特异性。但是噬菌体文库中的编码蛋白均为融合蛋白，可能改变天然蛋白质的结构和功能，其体外检测的相互作用可能与体内不符。

2.5　蛋白质工程中的定点突变技术

人类蛋白质组学的一个重要内容是疾病的比较蛋白质组学，蛋白质工程的核心内容就是在基因工程的基础上对蛋白质的编码基因的特定位点进行定点突变，改造蛋白质的特定功能结构域，从而可鉴定特定蛋白质的结构对功能的影响，通过蛋白质表达丰度的变化寻找疾病的诊断标记。应用该技术鉴定蛋白质的结构与功能的关系，将直接影响该蛋白质在临床上的诊断应用和药物开发研究。通过比较正常细胞、病态细胞及药物处理后的病态细胞的蛋白表达丰度的变化，也可以分析药物候选者的潜在作用。

3　展望

由于蛋白质组本身具有成分复杂且量微等特点，未来的分析技术应具备自动化、超微量、高通量和高特异性等性能优点。同时，蛋白质组学是一信息学科，基因组学有着密切联系，应建立高级智能化的咨询工具，从而最终实现功能蛋白质组图谱的建立。相信随着生物技术的发展，蛋白质组分析技术将会快速发展、日臻完善，蛋白质组学的研究也将更加系统化、自动化和标准化。

参考文献（略）

读博的经验，感觉还不错，大家过来看看。

1. 先看综述，后看论著

看综述搞清概念，看论著掌握方法 。

2. 早动手

在师兄师姐离开之前学会关键技术。

3. 多数文章看摘要，少数文章看全文

掌握了一点查全文的技巧，往往会以搞到全文为乐，以至于没有时间看文章的内容，更不屑于看摘要。真正有用的全文并不多，过分追求全文是浪费，不可走极端。当然只看摘要也是不对的。

4. 集中时间看文献

看过总会遗忘。看文献的时间越分散，浪费时间越多。集中时间看更容易联系起来，形成整体印象。

5. 做好记录和标记

复印或打印的文献，直接用笔标记或批注。pdf 或html 格式的文献，可以用编辑器标亮或改变文字颜色。这是避免时间浪费的又一重要手段。否则等于没看。

6. 准备引用的文章要亲自看过。

转引造成的以讹传讹不胜枚举。

7. 注意文章的参考价值。

刊物的影响因子、文章的被引次数能反映文章的参考价值。但要注意引用这篇文章的其它文章是如何评价这篇文章的：支持还是反对，补充还是纠错。

8. 交流是最好的老师

做实验遇到困难是家常便饭。你的第一反应是什么？反复尝试？放弃？看书？这些做法都有道理，但首先应该想到的是交流。对有身份的人，私下的请教体现你对他的尊重；对同年资的人，公开的讨论可以使大家畅所欲言，而且出言谨慎。千万不能闭门造车。一个实验折腾半年，后来别人告诉你那是死路，岂不冤大头？

9. 最高层次的能力是表达能力

再好的工作最终都要靠别人认可。表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培养的素质。比如发现一个罕见病例，写好了发一篇论著；写不好只能发一个病例报道。比如做一个课题，写好了发一篇或数篇论著；写不好只能发一个论著摘要或被枪毙。一张图,一张表,无不是表达能力的体现。寥寥几百上千字的标书，可以赢得大笔基金；虽然关系很重要，但写得太差也不行。有人说，我不学PCR，不学spss，只要学会ppt（powerpoint）就可以了。此话有一点道理，实验室的boss 们表面上就是靠一串串ppt 行走江湖的。经常有研究生因思维敏捷条例清楚而令人肃然起敬。也经常有研究生不理解"为什么我做了大部分工作而老板却让另一个没怎么干活的人写了文章？让他去大会发言？"你没有看到人家有张口就来的本事吗？

10. 学好英语，不学二外。

如今不论去日本还是欧洲，学术交流早已是英语的天下。你不必为看不懂一篇法语的文章而遗憾，写那篇文章的人正在为没学好英语而犯愁。如果英文尚未精通，暂且不要去学二外。

英文文章写作

1. 阅读10 篇文献，总结100 个常用句型和常用短语。经常复习。注意，文献作者必须是以英文为母语者，文献内容要与你的专业有关。这属于平时看文献的副产品。

2. 找3-5 篇技术路线和统计方法与你的课题接近的文章，精读。

写出论文的草稿。要按照标题、作者、摘要、背景、目的、材料、方法、结果、讨论、致谢、参考文献、图例、图、表、照片和说明的统一格式来写。这样做的好处是从它可以方便地改成任何杂志的格式。

3. 针对论文的每一部分，尤其是某种具体方法、要讨论的某一具体方面，各找5-8 篇文献阅读，充实完善。这里讨论的只涉及英文表达，也只推荐给缺乏英文写作经验的人。

4. 找到你想投的杂志的稿约，再找2-3 篇该杂志的article，按它的格式改写。注意，每次改写都要先另存为不同的文件名，以免出了问题不能恢复。

5. 找英文高手改。找不到合适的人，就去找提供英语论文编辑服务(English correction and improvement，not translation)的公司 ，在此向有钱没时间的人强烈推荐。

文献管理

1. 下载电子版文献时（caj，pdf，html），把文章题目粘贴为文件名。

注意，文件名不能有特殊符号，要把 \ / : * ? < > | 以及换行符 删。 每次按照同样的习惯设置文件名，可以防止重复下载。

2. 不同主题存入不同文件夹。文件夹的题目要简短，如：PD，LTP,PKC，NO。

3. 看过的文献归入子文件夹，最起码要把有用的和没用的分开。

4. 重要文献根据重要程度在文件名前加001,002，003 编号，然后按名称排列图标，最重要的文献就排在最前了。

5. 复印或打印的文献，用打孔器（￥10-15）打孔，装入硬质文件夹（￥10-20/个）。

我们经常会在参考文献的引用上耍一些小聪明，殊不知这些都会降低论文质量。

1. 知而不引

明明借鉴了同行的类似工作，却故意不引用同行的类似工作，使自己工作看上去"新颖""领先"。实际上审稿的可能就是同行。

2. 断章取义

故意截取作者试图否定的部分来烘托自己的观点。

3. 引而不确

没有认真看原文，引文错漏。

4. 来源不实

某些字句来源不可靠(比如非正式的或非学术的出版物)，且不注明来源。常见于一些统计数字。

5. 盲目自引

不是为了说明自己的工作与前期工作之间的关系，而是单纯为提高自己文章被引用次数而自引。

动态的科研

1. 科研靠积累。

象伦琴发现X 射线那样凭借一次简单观察就得诺贝尔奖的机会越来越少。更多的科研成果来自于实验室长期积累。最终实至名归。做科研不要指望一步登天。设计课题不要好高骛远。基金评审也是这样。没有前期积累，获得资助的可能性小。选导师要想好：你是要白手起家，还是要为人作嫁？

2. 文献要追踪。

开题时通过查文献了解的情况，到结题的时候可能有很大不同。实验过程中要注意追踪。运气好，你可以得到更多的线索；运气不好，发现别人抢先了。据此修正你的实验。写论文之前一定要重新查一遍文献。

3. 记录要复习。

前面的实验记录要经常复习。随着经验的增加和认识的提高，你会发现最初的判断未必正确。

写毕业论文

1. 先列提纲

不列提纲，上来就写，是坏习惯。几百字没问题，几千字勉强，几万字就难了。必须列出写作提纲，再充实完善，以保证思路的连贯和字数的均衡。

2. 平时多写

及时总结阶段性的工作，多写文章多投稿。到最后阶段，把这些文字有机地组合起来，就是一篇很好的毕业论文。

3. 不要罗列所有数据

为了保证毕业论文的分量，研究生往往会观测较多的指标。但毕业论文并非数据越多越好。一定要舍弃那些与主旨关系不大的数据。否则，要么显得累赘松散，要么成为破绽。

4. 打印修改

在电脑上直接修改，会遗漏很多错误。要尽可能地减少任何错误，一定要打印出来修改。

5. 让别人指出错误

自己修改，仍然受个人习惯的局限。错误摆在那里，却熟视无睹。让别人给你指出错误吧 ，不管他与你是不是同一专业。

怎样读文献

1. 目标：

漫无目的则毫无效率，抓不住重点才效率低下。选题之前可能会有一段时间处于迷茫状态，不知从哪入手。胡乱看了大量文献，却不知所以然。在导师的指导下，在同行的启发下，有些人可以迅速明确目标，有的放矢，入门就从这里开始。即使导师不导，没有定题，自己也要先设定一个具体的问题看文献。不管你将来做不做这些东西，总比没有目标好得多，保证有收获。科研的一般法则是共通的。

2. 层次：

对于一个具体的课题来说，相关文献分属于三个层次：研究方向、研究领域、研究课题。例如有人研究干细胞定向分化治疗帕金森病，对他来说，研究方向就是帕金森病，研究领域是帕金森病的干细胞治疗，研究课题是某种物质诱导干细胞定向分化为分泌多巴胺的神经细胞。看文献时要分清手上的文献是属于那个层次，这决定你对它要掌握到什么程度。

研究方向层次的文献：一般涉及，基础知识，学科水准，了解当前重大进展与趋势，达到专业人员水平；

研究领域层次的文献：了解焦点与热点，已/正/将进行的课题，达到专家水平；

研究课题层次的文献：要全面，了解历史、现状、展望、主要方法、手段，达到No1专家水平。

正确分辨文章的层次，才能把精力用到点子上。

3. 形式：

广义的文献包括可以阅读的所有出版形式。教科书、专著、会议摘要汇编、期刊、网页、甚至ppt文件。比如要了解免疫应答的基本形式，最好是看教科书；要参考大鼠脑立体定位图谱，最好是看专著；要知道最新进展，最好是查阅期刊；要了解别人的研究动向，最好是参会或看会议论文汇编。不要找错信息源。

4. 程度：

对文献的熟悉程度不同，阅读文献的方式大不相同。新手学习式阅读，逐字逐句，搞清细节，掌握最基本的知识点。最初的十几、几十篇要精读，精华的几篇甚至要背诵。老手搜索式阅读，已熟悉各种研究的常见模式和一般套路，能够迅速提取关键信息，把握思路，经常不按常规顺序阅读。有人看图说话，有人辨数识字。高手批判式阅读，一针见血，直指问题所在。实际上没有一篇论文是无懈可击的。新手要稳，老手要准，高手要狠。新手、老手、高手的代表人物分别是研究生、导师和审稿人，但认真钻研的研究生完全可以在3年中实现从新手到高手的嬗变。对自己有清醒的定位，才能选择正确的阅读方式。

5. 矛盾：

文献读的多了，脑子里塞满了信息。公说公有理，婆说婆有理，反而无所适从？为了解决这个问题，循证医学划分临床试验证据的等级；同理，我们看文献也要重视实验证据的强度。发现矛盾，是第一步；找出异同，是第二步；思考解决，是第三步。从相互矛盾的结论推导中发现矛盾的根源，此时如能跳出圈外，不走思维定势，从原始的科学问题出发，"无招胜有招"，真正是到达另外一种境界了。何必翻译外国人的综述谎称自己的综述？何必重复别人做过的实验谎称自己的思路？

    智商，就是IQ（Intelligence Quotient的简称)，通俗地可以理解为智力，是指数字、空间、逻辑、词汇、创造、记忆等能力，它是德国心理学家施特恩在1912年提出的。
智商表示人的聪明程度：智商越高，则表示越聪明。
想检验自己的智商是多少吗？这并不困难，以下就是一例国内较权威的IQ测试题，请在30分钟内完成（30题），之后你就会知道自己的IQ值是多少了。
1、选出不同类的一项：
A、蛇 B、大树 C、老虎
2、在下列分数中，选出不同类的一项：
A、3/5 B、3/7 C、3/9
3、男孩对男子，正如女孩对
A、青年 B、孩子 C、夫人 D、姑娘 E、妇女
4、如果笔相对于写字，那么书相对于
A、娱乐 B、阅读 C、学文化 D、解除疲劳
5、马之于马厩，正如人之于
A、牛棚 B、马车 C、房屋 D、农场 E、楼房
6、 2 8 14 20 （ ）
请写出" （ ） "处的数字。
7、下列四个词是否可以组成一个正确的句子
生活 水里 鱼 在
A 、是 B、否
8、下列六个词是否可以组成一个正确的句子
球棒 的 用来 是 棒球 打
A、是 B、否
9、动物学家与社会学家相对应，正如动物与（ ）相对
A、人类 B、问题 C、社会 D、社会学
10、如果所有的妇女都有大衣，那么漂亮的妇女会有
A、更多的大衣 B、时髦的大衣 C、大衣 D、昂贵的大衣
11、 1 3 2 6 5 7 （ ） ，请写出" （ ） "处的数字
12、南之于西北，正如西之于：
A、西北 B、东北 C、西南 D、东南
13、找出不同类的一项
A、铁锅 B、小勺 C、米饭 D、碟子
14、9 7 8 6 7 5 （ ），请写出" （ ） "处的数字
15、找出不同类的一项：
A、写字台 B、沙发 C、电视 D、桌布
16、961 （25） 432 932 （ ） 731 ，请写出（）内的数字
17、选项ABCD中，哪一个应该填在"XOOOOXXOOOXXX"后面
A、XOO B、OO C、OOX D、OXX
18、望子成龙的家长往往（ ）苗助长
A、揠 B、堰 C、偃
19、填上空缺的词：
金黄的头发（黄山）刀山火海
赞美人生（ ）卫国战争
20、选出不同类的一项：
A、地板 B、壁橱 C、窗户 D、窗帘
21、 1 8 27 （ ），请写出（ ）内的数字。
22、填上空缺的词：
罄竹难书（书法）无法无天
作奸犯科（ ）教学相长
23、在括号内填上一个字，使其与括号前的字组成一个词，同时又与括号后的字也能组成 一个词：
款（ ）样
24、填入空缺的数字：
16（96）12 10（ ）7.5
25找出不同类的一项：
A、斑马 B/span>、军马 C、赛马 D、骏马 E、驸马
26、在括号上填上一个字，使其与括号前的字组成一个词，同时又与括号后的字也能组成 一个词：
祭（ ）定
27、在括号内填上一个字，使之既有前一个词的意思，又可以与后一个词组成词
组：头部（ ）震荡
28、填入空缺的数字65 37 17 （ ）
29、填入空缺的数字41（28）27 83（ ）65
30、填上空缺的字母
CFI DHL EJ（）
答案：1、B 2、C 3、E 4、B 5、C 6、26 7、A 8、B 9、A 10、C 11、9 12、B 13、C 14、6 15、D 16、38 17、B 18、A 19、美国 20、D 21、58 22、科学 23、式 24、60 25、E 26、奠 27、脑 28、5 29、36 30、O
计算方法：每题答对得5分，答错不得分。共30题，总分150分。
结果分析：按照国际标准，人们对智力水平高低通常进行下列分类：智商在140分以上者称
为天才； 120~140之间为最优秀；100~120之间为优秀； 90~100之间为常才；80~90之间
为次正常； 70~80为临界正常； 60~70为轻度智力落后； 50~60为愚鲁； 20~25为痴鲁；
25以下为白痴

        

90个外国英文网站强力推荐 sr-: 资料来源： ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　GiD 作者：yishui 文章来源：积学论坛 点击数：634 更新时间：2006-2-12  RMNd ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　Fg 一、大陆可访问的优秀英文信息源 :Ou:X 1、英国《经济学家》 http://www.economist.com ^ 2、美联社 http://wire.ap.org/GoToAP.cgi /Hdk^L 3、英国BBC http://news.bbc.co.uk are( 4、《纽约时报》 http://www.nytimes.com 2v 5、普利策新闻奖1995年到2001年全部获奖作品 http://www.pulitzer.org 7 6、美国全国广播公司 http://www.msnbc.com/news [R[u 7、《华尔街日报》评论 http://www.opinionjournal.com A 8、香港《南华早报》 http://china.scmp.com/index.html ^2X ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　v0]+B+ 二、新闻收藏夹 hI_I 1、CNN可以直接访问的地址http://asia.cnn.com（亚洲版） D+MI 2、CNN可以通过代理服务器访问的地址http://207.25.71.5（国际版） <).Q 3、BBC可以通过代理服务器访问的地址http://212.58.240.36 l8)i& 4、《华盛顿邮报》社论版 可以通过代理服务器访问的地址：http://64.215.175.141/wp-dyn/opinion f ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　R`Vz! 三、英美外电新闻 yjn 1、《泰晤士报》http://www.thetimes.co.uk Tu]iJ 2、《基督教科学箴言报》http://www.csmonitor.com o1 3、《今日美国》http://usatoday.com { 4、美国广播公司http://abcnews.go.com qSZy* 5、英国《观察家》http://www.observer.co.uk _T 6、英国《每日电讯》http://www.dailytelegraph.co.uk r ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　D|8e 四、英美周刊杂志 C8C 1、《每周标准》http://www.weeklystandard.com u 2、《外交事务杂志》http://www.foreignaffairs.orghttp:/...eignaffairs.org jZc"fb 3、《沙龙》http://www.salon.com <C#+ 4、《美国观察者》http://www.gilder.com/amspec/index.html l http://www.gilder.com/amspec/index.html {B| http://www.gilder.com/amspec/index.html BKbs] 5、《新共和》http://www.tnr.com/ .{DZyh 6、《国家评论》http://www.nationalreview.com =v=) 7、《国家杂志》http://nationaljournal.com/about/njweekly/stories/ ld 8、《纽约客》http://www.newyorker.com/ :&B1-f 9、《纽约书评》 http://www.nybooks.com/ M,nT&T 10、《外交政策》http://www.foreignpolicy.com/ s 11、《大西洋月刊》The Atlantic Onlinehttp://www.theatlantic.com// zL8 12、《外交政策聚焦》http://www.foreignpolicy-infocus.org/ f]xhj- 13、《民族》The Nationhttp://www.thenation.com/ .zn 14、《进步》Homepage of The Progressive magazine http://www.progressive.org/ 48ga3N 15、《洋葱》http://www.theonion.com/（有趣新闻站点） h6 ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　(BSAF^ 五、时事资料 ;wj 1、安全政策研究中心http://www.centerforsecuritypolicy.org/ N.hc/A 2、美国国务院各国背http://www.state.gov/r/pa/bgn/ Caeu 3、世界各国地图http://www.lib.utexas.edu/maps/index.html %5z 4、卫星照片http://www.spaceimaging.com/ &|,\ 5、网上各国政府资料http://www.gksoft.com/govt/en/ _kE2ww 6、中国外交部各国背景http://www.fmprc.gov.cn/chn/c242.html Yk ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　Gr\xjs 六、英美常用经济网站 'RL 1、《金融时报》http://news.ft.com/home/rw Hv/:}, 2、《商业周刊》http://news.ft.com/home/rw ^<opP; 3、《财富》http://www.fortune.com/fortune Z?eV 4、《远东经济评论》http://www.feer.com G~ 5、《福布斯》http://www.forbes.com %oN"# 6、哥伦比亚广播公司《市场观察》http://cbs.marketwatch.com/news/default.asp?siteid=mktw S`C 7、《街》http://www.thestreet.com/ o5ce ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　hLs% 七、非英美周刊杂志和资料站点 +U438 1、德国《镜报》http://www.spiegel.de/spiegel（点击English Texts） Y>(+0H 2、教廷《罗马观察家》http://www.vatican.va/news_services..._eng/index.html "w8 3、捷克《布拉格邮报》http://www.praguepost.cz/ :1. 4、《俄罗斯周刊》http://www.russiajournal.com/ |oKO 5、英国《简氏防务周刊》http://www.janes.com/（出色的军事杂志） =jz 6、埃及《中东时报》http://www.metimes.com/ U.po 7、《巴勒斯坦时报月刊》http://www.ptimes.com/ o{CI| 8、巴勒斯坦《耶路撒冷时报》http://www.jerusalem-times.net/ <WTA|) 9、埃及《Al-Ahram周刊》http://www.ahram.org.eg/weekly/ B 10、阿富汗研究http://www.institute-for-afghan-studies.org/ 5Uc:PS 11、中东新http://www.middleeastwire.com/ Dmg~TG 12、以色列DEBKA档案http://www.debka.com/（一个情报站点） hA9 13、保加利亚《首都周刊》http://www-us.capital.bg/old/weekly/index.html a( 14、皇帝的新装http://www.emperors-clothes.com ; qhB6 15、全球主义者http://www.theglobalist.com/ W 16、台湾《东森新闻报》http://www.ettoday.com/ z by http://www.hjenglish.com im(% ©中国博士网 -- 中国博士网 www.chinaphd.com　　37E 八、非英美外电新闻 P<\Y 1、《东盟新闻》http://www.aseanreview.com 8 2、菲律宾《星报》http://www.philstar.com/htmtest/index.htm [> 3、菲律宾《每日调查》http://www.inq7.net/ uY)i 4、印尼《雅加达邮报》http://www.thejakartapost.com/headlines.asp %$t}7 5、新加坡《海峡时报》http://straitstimes.asia1.com.sg/home $%s'QG 6、巴基斯坦《黎明报》http://www.dawn.com w'L 7、《印度时报》http://www.timesofindia.com 2iSO|E 9、尼泊尔新闻http://www.nepalnews.com.np sRz 10、德国《法兰克福汇报http://www.faz.com/IN/INtemplates/eFAZ/default.asp k 11、俄罗斯《莫斯科时报》http://www.moscowtimes.ru Mys_ 12、保加利亚《新闻报》http://news.bg/en/ ; 13、保加利亚《索菲亚回声报》http://www.sofiaecho.com/ s 14、《爱尔兰时报》http://www.ireland.com/ Inq o 15、以色列《哈阿雷兹》http://www.haaretzdaily.com/ uW$2GF 16、伊拉克新闻http://www.uruklink.net/iraqnews/eindex.htm "r-uH4 17、《约旦时报》http://www.jordantimes.com Yw*IH 18、阿联酋《Khaleej时报》http://www.khaleejtimes.com/ _ 19、古巴《格拉玛》http://www.granma.cu/ingles/index.html (1RP=j 20、阿根廷《布宜诺斯艾利斯先驱报》http://www.buenosairesherald.com } 21、泛非洲在线http://allafrica.com/ Jji 22、联合国新闻中心http://www.un.org/News 4J 23、可以在线阅读英文小说 http://hnbc.hpe.sh.cn/01/01A/04/UVWX.HTM (q%TNu 24、《时代周刊》www.time.com 6~[Xh@ 25、《国家地理》http://www.nationalgeographic.com S&GYce 26、《新闻周刊》http://www.msnbc.com/news/NW-front_Front.asp

nature：生物遗传突变普遍机制

南京大学田大成课题组20日在顶级杂志nature在线发表研究论文“Single-nucleotide mutation rate increases close to insertions/deletions in eukaryotes”。这是南京大学首次作为通信单位发表nature论文。

变异热点常见于遗传序列和人体特定疾病发生的位点，但是这种现象发生的机理并不十分明确。南京大学科学家通过对六种独立物种基因组的研究，加入或剪切单个核苷酸后比较发现，在单个核苷酸插入或剪切位点附近00个核苷酸也较易发生改变。结果表明单个核苷酸插入或剪切会使其临近序列也具有很高的变异率。

田大成解释说，基因突变主要是指DNA中核苷酸顺序、种类和数量的改变，而DNA序列中普遍存在的点（碱基）突变是遗传变异的基本来源。点突变又分为自发突变和诱发突变。长期以来，学术界对自发突变机制的经典认识是，自发突变受一系列因素的影响，是一系列变化的结果，具有随机性和稀有性。但随着上个世纪90年代以来DNA测序技术的突破性进展，研究者们对自发突变在基因组中的数量和分布有了精确估计，并普遍认为“自发突变在基因组中不是随机分布的，突变热点普遍存在于基因组中”。这一结论对传统的自发突变随机性和稀有性的认识形成巨大挑战，而这种现象也引起了各国科学家的极大关注，但遗憾的是始终没有找到一种普遍的机制来解释这一重大的科学疑问。
 
田大成等发现的遗传突变新机制具有重大科学意义，成功破解了生物遗传学上的很多悬念：第一，基因组各区域的突变率很不相同，自发突变的数量是由Indel的数量和密度所决定，自发突变的数量在Indel附近并不稀有，远离Indel的区域是稀有的，但Indel本身是一种点突变，其发生有一定的随机性，因而其诱发的突变也有一定的随机性；第二，找到了多数自发突变的发生根源，也就是说，生物多样性的最初变异来源，主要是由Indel诱导产生；第三，自然选择在很大程度上是通过对Indel的选择而实现，而自发突变率的高低很大程度上也是自然选择的结果；第四，生物通过调节自身变异能力而适应环境的能力，比人们原先想象的要大得多，即突变在进化中的作用相当巨大。（生物谷Bioon.com）

生物谷推荐原始出处：Nature , | doi:10.1038/nature07175; Received 19 January 2008; Accepted 17 June 2008; Published online 20 July 2008

Single-nucleotide mutation rate increases close to insertions/deletions in eukaryotes

Dacheng Tian^1,4, Qiang Wang^1,4, Pengfei Zhang¹, Hitoshi Araki^1,2, Sihai Yang¹, Martin Kreitman³, Thomas Nagylaki³, Richard Hudson³, Joy Bergelson^1,3 & Jian-Qun Chen¹

1.State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Department of Biology, Nanjing University, Nanjing 210093, China

2.Department of Fish Ecology and Evolution, EAWAG Center of Ecology, Evolution and Biogeochemistry, 6047 Kastanienbaum, Switzerland

3.Department of Ecology & Evolution, University of Chicago, Chicago, Illinois 60637, USA

4.These authors contributed equally to this work.

Correspondence to: Dacheng Tian^1,4Jian-Qun Chen¹ Correspondence and requests for materials should be addressed to D.T. (Email: dtian@nju.edu.cn) or J.-Q.C. (Email: chenjq@nju.edu.cn).

Abstract

Mutation hotspots are commonly observed in genomic sequences and certain human disease loci^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7}, but general mechanisms for their formation remain elusive^{7, 8, 9, 10, 11}. Here we investigate the distribution of single-nucleotide changes around insertions/deletions (indels) in six independent genome comparisons, including primates, rodents, fruitfly, rice and yeast. In each of these genomic comparisons, nucleotide divergence (D) is substantially elevated surrounding indels and decreases monotonically to near-background levels over several hundred bases. D is significantly correlated with both size and abundance of nearby indels. In comparisons of closely related species, derived nucleotide substitutions surrounding indels occur in significantly greater numbers in the lineage containing the indel than in the one containing the ancestral (non-indel) allele; the same holds within species for single-nucleotide mutations surrounding polymorphic indels. We propose that heterozygosity for an indel is mutagenic to surrounding sequences, and use yeast genome-wide polymorphism data to estimate the increase in mutation rate. The consistency of these patterns within and between species suggests that indel-associated substitution is a general mutational mechanism.

 

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969

Max Delbrück, Alfred D. Hershey and Salvador E. Luria

for their discoveries concerning "the replication mechanism and the genetic structure of viruses".

Summary

Around 1940 Delbrück, Hershey and Luria became interested in bacteriophage, a type of virus that infects bacteria, rather than ordinary cells. They were trying to find a living system as simple as possible, on which to study with hope of success, fundamental life processes, first of all self-replication. Bacteriophage soon revealed itself to be an object of choice for such research. They worked out rigorous quantitative methods and this turned bacteriophage research into an exact science. They synchronized virus multiplication and were thus able to follow in detail the various phases in the process. They studied what happened in single cells and analyzed their results with advanced statistical methods. They made a series of fundamental discoveries, of which the following will be mentioned.

As a result of infection, both virus and cell undergo drastic changes. The so-called cell-virus-complex behaves as an essentially new system. The chemical activities of the cell are reprogrammed. The virus loses its individuality and enters an "eclipse" or "dark" phase, during which it can no longer be identified as a particle. The metabolic activities which it releases can lead in a matter of minutes to the formation of hundreds of new virus particles.

The virus particle consists principally of nucleic acid surrounded by a protein shell. At infection the nucleic acid is injected by a simple but extremely efficient mechanism into the cell, while the protein shell remains outside. The role of nucleic acid as the carrier of the genetic information of the virus was thus demonstrated. The discovery of numerous genetic variants of the virus showed that the latter contained more than a single gene. Soon after genetic recombination was discovered to take place: two virus particles simultaneously infecting the same cell can exchange parts of their strings of genes and give origin to hybrid forms. This phenomenon made ossible a detailed analysis of the genetic structure of the virus. Thanks to the short reproduction time of the virus and the large number of progeny virus obtained, bacteriophage work, in a matter of hours, can yield information that with other virus material might require months or years.

The work of Delbrück, Hershey and Luria has had a great impact on biology in general. Bacteriophages have served and continue to serve as models for the more complicated and less approachable systems represented by animal and human cells. Delbrück, Hershey and Luria have set the solid foundations on which modern molecular biology rests. Without their contributions the explosive development of this field would have been hardly possible. From the medical point of view, the discoveries for which the award is now given first of all imply a deeper insight into the nature of viruses and of virus diseases. Indirectly they also bring about an increased understanding of the mechanism of inheritance and of those mechanisms that control the development growth and function of tissues and organs. Over the years our debt of gratitude to the three leading figures of bacteriophage research has continually increased.

1993年10月13日，在瑞典斯德哥尔摩的皇家科学院，将1993年的诺贝尔化学奖授予两位从事生物化学研究的科学家——美国的Kary B Mullis和加拿大的Michael Smith，以表彰他们在遗传工程领域研究中各自取得的突破性成就。

一 多聚酶链式反应（PCR）技术

K.B.Mullis1944年生于美国。他在1983年的一次深夜驾车时，大脑中猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法，同时他也意识到这一设想如果可行，他将会名扬天下。在1985年，他发明出这种多聚酶链式反应（Polymerase chain reaction，简称为PCR）。1992年，他就因这一成就而荣获日本颁发的45万美元的奖金。1993年，他又幸运地与Michael Smith分享了670万克朗（84.5万美元）的诺贝尔化学奖。从80年代末期开始，Mullis发明的PCR方法被用来在体外扩增特定的DNA片段。因而，这一方法也常常被称为“基因放大”。Mullis因发明PCR方法而成名之后，就开始写他的第一本书，书中详细披露多聚酶链式反应的研究过程以及随后的法律争端。

1.基本原理

首先，根据待扩增DNA片段两端的核苷酸序列，用化学合成的方法，合成2个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的2条链互补配对。将过量的化学合成引物与4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶以及含有待扩增片段的DNA分子混合，经过高温变性（使DNA双链解开）、低温退火（使引物与模板附着）和中温延伸（合成新的DNA片段）3个阶段的多次循环（图1）。由于新合成的DNA链也能够作为模板，可以使模板DNA的信息以几何级数扩增。一般经过30—35次扩增循环，每一个循环只需要3—10分钟，可以得到足够的目的DNA片段，使基因放大了数万倍。

PCR的方法灵敏度高，扩增倍数大，对一段2000个碱基对长的DNA，可以从原来的1×10^－12g扩增到（0.5—1.0）×10^-6g。在结合其他生物化学方法时，可以检测出占总DNA的1/10¹³比例的单拷贝序列。

2.影响PCR方法的一些因素及改进措施

在PCR操作中，确定2个寡聚核苷酸引物是扩增目的DNA片段的关键。要扩增某一DNA片段，必须首先知道这一段DNA相邻两端的核苷酸序列，才能用化学方法合成出PCR引物。引物的长度不能少于16个核苷酸，以保证引物与模板的特异性吸附。但也不必合成太长的引物，以免造成浪费。

在PCR方法早期被利用时，一般选用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来合成新生DNA，但是Klenow在DNA高温解链时会变性失活，因此，每一个循环都要补充新的酶，这就限制了扩增DNA的长度。1988年，Erlich等人报道了耐热的Taq DNA聚合酶的分离纯化，它可以在高温下保持活性，适合于PCR操作的使用，这也使PCR技术得到简化并推入应用阶段；而且，Taq酶可以在高温下进行聚合反应，也提高了引物与模板之间的退火结合的特异性。但是，Taq酶的酶量仍然是制约反应程度的因素，因此，这一扩增不可能在一个体系内不断进行下去，一般只能进行30个左右的循环。要继续进行扩增，必须要对第一次扩增的产物进行稀释，作为后一轮的模板，开始新的PCR反应。

由于Taq DNA聚合酶缺乏对错误的校正功能，在PCR过程中会有一定频率的错误合成。对30轮循环的PCR反应来说，可导致0.25％的总错误率。因此，如果需要扩增某一DNA片段，需对两个或更多的克隆进行DNA的序列分析，以确定正确的扩增DNA序列。

3.PCR技术的应用和意义

作为一种生物化学技术，PCR在分子生物学中应用十分广泛，已经成为一种基本的实验技术。它主要应用于从mRNA建立cDNA文库、微量DNA测序、核酸探针的合成以及突变DNA的分析，等等。

由于PCR不仅具有高灵敏度，而且易于操作，不需要复杂的仪器设备，因而尽管PCR还是一种新技术，但已在许多与生物学相关的领域内得到了广泛的应用。临床医学上的肿瘤检测、遗传性疾病的诊断以及感染性疾病病原体（如艾滋病）的鉴定、法医学中现场标本的遗传学分析等，都有很多利用PCR进行操作的实例。瑞典皇家科学院评价：将PCR方法与DNA序列分析结合起来，很可能会成为研究动植物分类学的一种革新工具。由此可见，PCR技术解决了许多人们以往难以涉及的问题，为人类进行微量遗传物质的分析和研究提供了有效的方法。

近几年来，经过许多生物化学工作者的研究，PCR方法的内容也在不断地扩展和完善，已经成为生物学研究中应用最广泛的技术之一。

  二  寡聚核苷酸定点诱变技术

  M.Smith于1932年出生于英国，毕业于英国的曼彻斯特大学，1956年移居加拿大。曾任加拿大温哥华大不列颠哥伦比亚大学生物技术实验室主任。在英国剑桥大学作客座教授期间，他在一次工作休息喝咖啡时与同事讨论中突然想到一个主意：如果合成一个略加改造的寡聚核苷酸，并作为引物来与一个DNA分子结合，再使其进入一个合适的宿主体内复制，从理论上讲，应该能引起DNA分子的突变，并产生一种改变了的蛋白质。到了1978年，Smith与他的同事对这一想法进行了试验，发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。这一方面被用来在体外对已知的DNA片段内的核苷酸进行置换、增删的突变。这就改变了以往的对遗传物质DNA进行诱变时的盲目性和随机性，可以根据实验者的设计而有目的地得到突变体。

1.基本原理

应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到M13噬菌体载体中。M13噬菌体的正链可以感染具有性纤毛的细菌，并在菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型M13。受M13噬菌体感染的细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成较透明的噬菌斑。

将目的DNA插入到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要设计并合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加入DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物延伸，并用DNA连接酶使新合成的DNA成环状，再去转染细菌。可用DNA序列分析的方法从得到的噬菌体中筛选出带有突变DNA序列的突变体。在制备出含有突变体的复制型DNA后，可以用突变的DNA片段置换未突变的DNA相应的区段，从而得到完整的DNA突变体。

2.寡聚核苷酸定点诱变方法的改进

Smith在1985年的一篇文章中提出了体外增加生成错配的异源双链效率的方法。在此前后，也有许多生物学工作者对这一方法的各个环节进行了研究，以使其更加有效和完善。

Wallace等人摸索出使突变核苷酸错配的条件，并提出了应用寡聚核苷酸探针进行杂交的方法来筛选突变体；Kunkel利用制备含尿嘧啶脱氧核糖核苷酸的DNA模板技术，降低了带非突变DNA噬菌体出现的频率；针对突变的不同情况及其难易程度，许多经验公式和条件也已被确立，又有一系列实用的M13噬菌体载体被构建和发展。由于这些改进，寡聚核苷酸定点诱变技术已经可以用来对任意已知的DNA序列进行改变。有时，往往只有用这一方法才能达到导入突变的目的。

3.寡聚核苷酸定点诱变技术的应用和意义

利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。目前，利用寡聚核苷酸定点诱变来进行酶及其他一些蛋白质的稳定性、专一性和活性的研究，已经有很多实例。例如，对胰蛋白酶的功能基团的研究、高效溶栓蛋白类药物的研制、白细胞介素-2结构与功能的分析等等，都必须利用这一方法。可见，它为酶的工业化以及临床应用开辟了新途径。因此，作为分子生物学中的一个热门领域的蛋白质工程，其研究方法和途径都离不开寡聚核苷酸定点诱变这方法。随着基因工程技术在医学及其他领域内的不断渗透和应用，寡聚核苷酸定点诱变还有其更广泛的发展前景。

由上可见，PCR和寡聚核苷酸定点诱变这两项技术，已经成为基因工程操作中先进的而又基本的方法和工具。PCR技术的广泛应用，使得在某些情况下的寡聚核苷酸定点诱变能够变得更简便和有效。同时，也正是由于寡聚核苷酸定点诱变技术的发展，使得PCR技术有了新的用途。在未来的分子生物学研究中，这两项技术也一定会不断增添新的内容，为人类带来新的发现。

        这是林木遗传学和林木育种新技术两门课程的申请考试时间，供参考，具体时间以官方公布的为准！

1，课程代码：BB017002；课程名称：林木遗传学；考试时间：15周2（12月11日），9:00-11:10(考教分离)；考试地点：南校区主楼E207。

2，课程代码：ZRX017002；课程名称：林木育种新技术；考试时间：15周7（12月16日），13:30-15:10；考试地点:南校区主楼E207。

园艺植物育种学复习提纲

一．名词解释

1．遗传：子代与亲代 性状相似的现象。（1）遗传只是一种自然现象；（2）该现象只发生于有亲缘关系的两生物间。

2．性状：生物形态特征与生理特性的总称。

3．基因型　遗传物质的总称。通常指所研究性状的基因组成。

4．表现型　指所研究的生物性状。

5．变异　子代与亲代之间以及各子代个体之间性状不相似的现象。

6．核型：每一生物的染色体数目、大小及其形态特征都是特异的，这种特定的染色体组成称为染色体组型或核型

7．同源染色体：生物体细胞中，形态、结构、功能、大小基本相同，在减数分裂时可发生联会的两条染色体，相互称为同源染色体

8．复等位基因：多个基因占据在染色体的相同位点，这些等位基因，一般称为复等位基因。

9．质量性状：这种呈现不连续变异的性状，叫做质量性状。

10．数量性状：此外，生物界还广泛存在着另一种性状，它们的变异不容易归属于少数截然不同的组别，中间有一系列的过渡类型，彼此间只有数量的差别，没有明显的质的界限，这种表现连续变异的性状叫做数量性状。

11．遗传力：是一个性状的遗传方差或加性方差在表型中的比率。其大小反映了该数量性状受遗传基因和环境因素影响的程度，遗传力越大，则该性状在遗传上越稳定，否则，该性状越易受环境影响。

12．种质资源（Germplasm resources）是园林植物材料中将其特定的遗传信息传递给后代并能表达的遗传物质总称。一切携带基因的繁殖材料都是种质资源

13．引种驯化：就是把外地的或外国的栽培植物引入本地，或由本地、外地或外国引入野生植物，突破原来的自然生长区，引进到新地区种植，经过人工培育，使之适应在新的条件下生长、发育。

14．实生选种：是在自然授粉产生的种子播种后形成的实生植株群体中，采和混合选择或单株选择得到新品种的方法。

15．芽变选种：是选择突变芽及其长成的枝，经过无性繁殖，进一步选育出新品种的方法。

16．家系：具有相同母本或相同父本的植物群体，称为家系。

17．无性系：在原始母株上采集无性繁殖材料，经无性繁殖形成的植物群体，称为无性系。

18．杂交：两种遗传基础（基因型）不同的异性配子结合称为杂交。

二．分析题

1．豌豆种子黄色（Y）对绿色（y）为显性，圆粒（R）对皱粒（r）为显性，基因型为YyRr的黄色圆粒植株与基因型为Yyrr的黄色皱粒植株杂交，其F1的基因型及表现型是怎样的？

解：基因型

（1YY : 2Yy : 1yy）（1Rr : 1rr） →

1YYRr : 1YYrr : 2YyRr : 2Yyrr : 1yyRr : 1yyrr

表现型

（3黄 : 1绿）（1圆 : 1皱）→

3黄圆 : 3黄皱 : 1绿圆 : 1绿皱 

2．P       PrPrvgvg  ×  prprVgVg

       紫色眼退化翅      红色眼正常翅

↓

F1       PrprVgvg       ×prprvgvg

       紫常           红退

↓

测交后代       紫退       红常       紫常       红退

观察值    965  1067       157  146

期望值    583.75    583.75    583.75    583.75

试计算杂交后代的交换率。

解：Rf = ( 151+154 ) / (1339+1195+151+154) ×100%  = 10.7 %

三．回答问题

1．种质资源的作用。

种质资源是育种工作的物质基础；种质资源是不断发展新观赏植物的主要来源；适应生产的不断发展，需要发掘更多的种质资源。

2．什么是品种？品种应该具有哪些特性？

品种是人们选择创造的、性状相似且能稳定的、有栽培或经济价值的植物群体。应该具有遗下特性：

优良：指群体作为品种时，其主要性状或综合经济性状符合市场要求，有较高的经济效益。

适应：包含对一定地区气候、土壤、病虫害和不时出现的逆境的适应和对一定的栽培管理和利用方式，如对肥、水充足的适应等。

整齐：指品种的性状整齐一致。

稳定指采用适于该类品种的繁殖方式的情况下保持前后代遗传的稳定。纯合体→有性繁殖，杂合体→无性繁殖

特异：指作为一个品种，至少有一个以上明显不同于其它品种的可辩认的标志性状。

3．本地资源有哪些优缺点？

本地种质资源是育种工作最基本的基因资源，它是在当地自然和栽培条件下长期形成的。

优点：对当地具有高度的适应性和抗逆性，取材方便；方园林植物可以充分体现当地特色。

缺点：某些性状不便于广泛推广。本地种质资源可通过评选，好的可直接利用，有的可作为杂交的亲本。

4．种质资源如何保存？

就地保存：    建立自然保护区，适于野生资源的保存。

异地种植保存：各级植物园：适于物种、变种的保存，也保存少量品种。种质资源圃：适于品种保存

离体保存：（1）种子低温保存    将含水量低的键全种子，装在密封的容器中，放在低温、干燥、黑暗的贮藏库中，则可较长期的保存种子的生活力。（2）组织培养保存    占地少，保存种类多，成本低，是一种值得推行的保存方式。但一般的保存技术不能满足需要，有两种技术值得关注：即缓慢生长系统和超低温保存系统。（3）缓慢生长系统    可使组织培养材料生长缓慢，从而减少培养基更新的频率，大大减轻了组织培养保存中的工作量，从而提高了保存效率。（4）超低温保存系统    是近十几年来新开发的一种技术，保存温度可低至-80~-196℃，适于植物器官、组织和细胞的保存，此时，细胞的整个代谢和生长活动都完全停止。

利用保存：特指稀有珍贵植物，可以通过广泛栽培利用而使之得以保存。

5．引种成功的标准是什么？

不需要特殊的保护，能够正常生长。没有丧失原有的经济或观赏价值。容易繁殖。

6．选种的意义是什么？

选种作为独立的育种手段，可直接产生大量品种。目前在生产中应用的许多品种是通过选种得到的。而且选种也是人类应用最早的一种育种方法。选择也是其它育种手段不可缺少的重要环节，其它育种手段，如杂交育种、引种等，均必须经过选择才能形成品种。实生选种是可保持较宽的遗传基础，实生选种是利用实生植株选育品种的方法，基础基础宽广，在目前育种基础愈来愈窄的情况下，显得日益重要。芽变选种可进一步改良其它手段得到的准优良品种，更适于推广。芽变选种主要用于对集约化管理程度比较高的无性系品种（主是是果树和花卉）的个别性状作改良，这些品种要求的性状较高，难以通过实生选种或杂交育种得到完全符合需要的品种。

7．单株选择和混合选择有什么优缺点？

8．什么是杂种优势？影响杂种优势的因素有哪些？

杂种优势：是指两个遗传组成不同的亲本杂交产生的杂种一代，在生长势、生活力、繁殖力、抗逆性、产量和品质上比其双亲优越的现象。

杂种优势的大小，大多数取决于双亲性状间的相对差异和相互补充程度；杂种优势大小与双亲基因型的纯合程度密切相关；杂种优势大小与性状的性质有关；杂种优势的大小与环境条件的作用也有密切关系。

9．如何选配杂交亲本？

杂交亲本选配需遵循以下几项原则：亲本应该具有育种目标所需要的优良性状，且优点要突出；亲本之间的优缺点要互补；最好选不同的生态型；选择亲本时要考虑两亲本遗传传递力的强弱（显隐性，质量性状-数量性状）；选择亲本时了解各品种所具性状之间的相关性；选择结实性强的个体做母本，以花粉多而正常的做父本。

10．造成品种退化的主要原因是什么？

机械混杂与生物学混杂：机械混杂又包括混杂非生物杂质、混杂其它物种、混杂同种其它品种等。生物学混杂在异花授粉植物和常异花授粉植物的品种间和种间最易发生，自花授粉的植物中间也间或发生。

不适宜的外界环境条件和栽培技术：由于栽培和管理措施不当，植物个体未表现出应有的优良性状。不过这种退化是不遗传的。

缺乏选择，造成优良性状退化：由于基因突变的存在，非目标性状会愈来愈多。

长期进行无性繁殖或近亲繁殖造成生活力衰退：长期的无性系殖，会使繁殖材料所处的发育阶段愈来愈老化。长期的近亲繁殖，一方面会使植物材料纯合度过高，另一方面也会使不利的隐性性状表现出来。

另外，病毒的感染也是品种退化的一个主要原因。

四．论述题

园艺植物类型多样，既有种子繁殖的一年生草本植物，又有通过无性方式繁殖的木本植物，也有通过种子繁殖的木本植物，如何确定他们的育种途径？

下面是几条在生产中常用的途径：1．一、二年生作物：单株选择（结合混合选择）→纯育品种、自交系或利用其杂种一代。2．多年生木本植物：混合选择→混杂植物群体。3．多年生可无性繁殖木本植物：单株选择→无性系测定→无性系品种。4．多年生木本植物：单株选择→采种园或采种圃→子代测定→更高级的采种园或采种圃。

The Nobel Prize in Chemistry 2006

4 October 2006

The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize in Chemistry for 2006 to

Roger D. Kornberg
Stanford University, CA, USA

"for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription".

A family story about life

In order for our bodies to make use of the information stored in the genes, a copy must first be made and transferred to the outer parts of the cells. There it is used as an instruction for protein production – it is the proteins that in their turn actually construct the organism and its function. The copying process is called transcription. Roger Kornberg was the first to create an actual picture of how transcription works at a molecular level in the important group of organisms called eukaryotes (organisms whose cells have a well-defined nucleus). Mammals like ourselves are included in this group, as is ordinary yeast.

Transcription is necessary for all life. This makes the detailed description of the mechanism that Roger Kornberg provides exactly the kind of "most important chemical discovery" referred to by Alfred Nobel in his will.

If transcription stops, genetic information is no longer trans­ferred into the different parts of the body. Since these are then no longer renewed, the organism dies within a few days. This is what happens in cases of poisoning by certain toadstools, like the death cap, since the toxin stops the transcription process. Understanding of how transcription works also has a fundamental medical importance. Disturbances in the transcription process are involved in many human illnesses such as cancer, heart disease and various kinds of inflammation.

The capacity of stem cells to develop into different types of specific cells with well-defined functions in different organs, is also linked to how the transcription is regulated. Understanding more about the transcription process is therefore important for the development of different therapeutic applications of stem cells.

Forty-seven years ago, the then twelve-year-old Roger Kornberg came to Stockholm to see his father, Arthur Kornberg, receive the Nobel Prize in Physiology or Medicine (1959) for his studies of how genetic information is transferred from one DNA-molecule to another. Kornberg senior had described how genetic information is transferred from a mother cell to its daughters. What Roger Kornberg himself has now done is to describe how the genetic information is copied from DNA into what is called messenger-RNA. The messenger-RNA carries the information out of the cell nucleus so that it can be used to construct the proteins.

Kornberg's contribution has culminated in his creation of detailed crystallographic pictures describing the transcription apparatus in full action in a eukaryotic cell. In his pictures (all of them created since 2000) we can see the new RNA-strand gradually developing, as well as the role of several other molecules necessary for the transcription process. The pictures are so detailed that separate atoms can be distinguished and this makes it possible to understand the mechanisms of transcription and how it is regulated.

Roger D. Kornberg, born 1947 (59) in St Louis, MO, USA (US citizen). PhD from Stanford University, CA, USA. Mrs. George A. Winzer Professor in Medicine at Stanford University School of Medicine, CA, USA.

The Prize amount: SEK 10 million.

FROM：http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2006/index.html

for their discovery of

"RNA interference – gene silencing by double-stranded RNA"

Summary

This year's Nobel Laureates have discovered a fundamental mechanism for controlling the flow of genetic information. Our genome operates by sending instructions for the manufacture of proteins from DNA in the nucleus of the cell to the protein synthesizing machinery in the cytoplasm. These instructions are conveyed by messenger RNA (mRNA). In 1998, the American scientists Andrew Fire and Craig Mello published their discovery of a mechanism that can degrade mRNA from a specific gene. This mechanism, RNA interference, is activated when RNA molecules occur as double-stranded pairs in the cell. Double-stranded RNA activates biochemical machinery which degrades those mRNA molecules that carry a genetic code identical to that of the double-stranded RNA. When such mRNA molecules disappear, the corresponding gene is silenced and no protein of the encoded type is made.

RNA interference occurs in plants, animals, and humans. It is of great importance for the regulation of gene expression, participates in defense against viral infections, and keeps jumping genes under control. RNA interference is already being widely used in basic science as a method to study the function of genes and it may lead to novel therapies in the future. 

The flow of information in the cell: from DNA via mRNA to protein

The genetic code in DNA determines how proteins are built. The instructions contained in the DNA are copied to mRNA and subsequently used to synthesize proteins (Fig 1). This flow of genetic information from DNA via mRNA to protein has been termed the central dogma of molecular biology by the British Nobel Laureate Francis Crick. Proteins are involved in all processes of life, for instance as enzymes digesting our food, receptors receiving signals in the brain, and as antibodies defending us against bacteria.

Our genome consists of approximately 30,000 genes. However, only a fraction of them are used in each cell. Which genes are expressed (i.e. govern the synthesis of new proteins) is controlled by the machinery that copies DNA to mRNA in a process called transcription. It, in turn, can be modulated by various factors. The fundamental principles for the regulation of gene expression were identified more than 40 years ago by the French Nobel Laureates François Jacob and Jacques Monod. Today, we know that similar principles operate throughout evolution, from bacteria to humans. They also form the basis for gene technology, in which a DNA sequence is introduced into a cell to produce new protein.

Around 1990, molecular biologists obtained a number of unexpected results that were difficult to explain. The most striking effects were observed by plant biologists who were trying to increase the colour intensity of the petals in petunias by introducing a gene inducing the formation of red pigment in the flowers. But instead of intensifying the colour, this treatment led to a complete loss of colour and the petals turned white! The mechanism causing these effects remained enigmatic until Fire and Mello made the discovery for which they receive this year's Nobel Prize.

 The discovery of RNA interference

Andrew Fire and Craig Mello were investigating how gene expression is regulated in the nematode worm Caenorhabditis elegans (Fig. 2). Injecting mRNA molecules encoding a muscle protein led to no changes in the behaviour of the worms. The genetic code in mRNA is described as being the 'sense' sequence, and injecting 'antisense' RNA, which can pair with the mRNA, also had no effect. But when Fire and Mello injected sense and antisense RNA together, they observed that the worms displayed peculiar, twitching movements. Similar movements were seen in worms that completely lacked a functioning gene for the muscle protein. What had happened?

When sense and antisense RNA molecules meet, they bind to each other and form double-stranded RNA. Could it be that such a double-stranded RNA molecule silences the gene carrying the same code as this particular RNA? Fire and Mello tested this hypothesis by injecting double-stranded RNA molecules containing the genetic codes for several other worm proteins. In every experiment, injection of double-stranded RNA carrying a genetic code led to silencing of the gene containing that particular code. The protein encoded by that gene was no longer formed.

After a series of simple but elegant experiments, Fire and Mello deduced that double-stranded RNA can silence genes, that this RNA interference is specific for the gene whose code matches that of the injected RNA molecule, and that RNA interference can spread between cells and even be inherited. It was enough to inject tiny amounts of double-stranded RNA to achieve an effect, and Fire and Mello therefore proposed that RNA interference (now commonly abbreviated to RNAi) is a catalytic process.

Fire and Mello published their findings in the journal Nature on February 19, 1998. Their discovery clarified many confusing and contradictory experimental observations and revealed a natural mechanism for controlling the flow of genetic information. This heralded the start of a new research field. 

The RNA interference machinery is unraveled

The components of the RNAi machiney were identified during the following years (Fig 3). Double-stranded RNA binds to a protein complex, Dicer, which cleaves it into fragments. Another protein complex, RISC, binds these fragments. One of the RNA strands is eliminated but the other remains bound to the RISC complex and serves as a probe to detect mRNA molecules. When an mRNA molecule can pair with the RNA fragment on RISC, it is bound to the RISC complex, cleaved and degraded. The gene served by this particular mRNA has been silenced. 

RNA interference – a defense against viruses and jumping genes

RNA interference is important in the defense against viruses, particularly in lower organisms. Many viruses have a genetic code that contains double-stranded RNA. When such a virus infects a cell, it injects its RNA molecule, which immediately binds to Dicer (Fig 4A). The RISC complex is activated, viral RNA is degraded, and the cell survives the infection. In addition to this defense, higher organisms such as man have developed an efficient immune defense involving antibodies, killer cells, and interferons.

Jumping genes, also known as transposons, are DNA sequences that can move around in the genome. They are present in all organisms and can cause damage if they end up in the wrong place. Many transposons operate by copying their DNA to RNA, which is then reverse-transcribed back to DNA and inserted at another site in the genome. Part of this RNA molecule is often double-stranded and can be targeted by RNA interference. In this way, RNA interference protects the genome against transposons. 

RNA interference regulates gene expression

RNA interference is used to regulate gene expression in the cells of humans as well as worms (Fig 4B). Hundreds of genes in our genome encode small RNA molecules called microRNAs. They contain pieces of the code of other genes. Such a microRNA molecule can form a double-stranded structure and activate the RNA interference machinery to block protein synthesis. The expression of that particular gene is silenced. We now understand that genetic regulation by microRNAs plays an important role in the development of the organism and the control of cellular functions. 

New opportunities in biomedical research, gene technology and health care

RNA interference opens up exciting possibilities for use in gene technology. Double-stranded RNA molecules have been designed to activate the silencing of specific genes in humans, animals or plants (Fig 4C). Such silencing RNA molecules are introduced into the cell and activate the RNA interference machinery to break down mRNA with an identical code.

This method has already become an important research tool in biology and biomedicine. In the future, it is hoped that it will be used in many disciplines including clinical medicine and agriculture. Several recent publications show successful gene silencing in human cells and experimental animals. For instance, a gene causing high blood cholesterol levels was recently shown to be silenced by treating animals with silencing RNA. Plans are underway to develop silencing RNA as a treatment for virus infections, cardiovascular diseases, cancer, endocrine disorders and several other conditions.

Reference:
Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391:806-811.

Andrew Z. Fire, born 1959, US citizen, PhD in Biology 1983, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Professor of Pathology and Genetics, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA.

Craig C. Mello, born 1960, US citizen, PhD in Biology 1990, Harvard University, Boston, MA, USA. Professor of Molecular Medicine and Howard Hughes Medical Institute Investigator, Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA.

 FROM：http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/index.html

    师妹留言贺老师去世了！不敢相信，打电话核实，原来贺普超教授五月二十四日在杨凌医院辞世，深感悲痛！
      与贺先生的第一次谋面是在1996年的夏天，那时先生家还在旧楼。入门后没有多的寒暄，只感到先生说起葡萄就眉飞色舞。
      后来在几次联谊活动中也见过先生几面，先生幽默风趣的谈吐，给我留下了深刻的印象。
      2000年我在先生执教的学校读书，先生曾经经手的种质资源材料也从原来的园艺场搬迁到了校北门现 在的地点。那时，我经常要到实验田里去采样，每每遇到先生以70多岁高龄还在田间观察记录的身影，感受良多。
      记得有一次先生上午坐出租车到实验地观察记载，快12点了，他说，出租车说好要来接我回去，怎么到现在还不见来？我也想不出原因，不过先生腿脚不好，走路有点吃力，我就说：“那干脆坐我的自行车，我把你带回学校。”一时也没有更好的办法，先生迟疑了片刻，就坐在我的自行车上，我把他带回了学校。走在路上，先生还念叨种质圃里网脉葡萄死掉了，他想到甘肃天水等地再去找找。我说那里是我的老家，他就让我假期到天水植物所找找。后来我也东奔西波，先生要我找网脉葡萄的事情，现在竟然成了一个未了的心事。
      和先生最有趣的一件事是在校园里，先生看见我走过来，老远就招手，冲我直喊我导师的名字，我的导师是先生的博士，我和我的导师相貌有点像，我走到先生跟前笑着说：“是我，不是他”，先生哈哈大笑。后来，这个故事也就成了我和我的师兄弟们经常说笑的一个素材，每每说起来都感到温馨和蔼。说到这里，先生所独有的、稍带沙哑的陕腔就萦绕在我的耳旁，先生短小、微微弯曲但又矍铄的身影就在我的眼前！
      那是2002年夏天吧，有一个法国人在我的老家要开办一个葡萄庄园。我家乡林业局领导和留法的韩博士来先生执教的学校考察，期间，法国来的韩博士提出要见见贺老师，我就领他们到先生家里去了一趟，那时先生家已经搬到了现在的教授楼。那天先生还给了我一些葡萄种质资源描述方面的文献。

最后一次见到先生是在2003年6月23日我的毕业答辩会上，那天李振岐院士也在场。答辩会上几个评委给我提了好多问题，每有一个问题，先生就给我指点几句，答辩当然也就顺利通过了。答辩完后，先生说我是真正的高级讲师！     
      给我的导师发了一条短信：“惊悉贺老师仙逝，谨通过您表达我对贺老师的深切哀悼！明天端午节了，祝你阖家万事如意！”导师给我回复：“谢谢你！贺老师不幸突然与世长辞了，我深感悲痛！我们只有老老实实做人，好好工作以告慰他的在天之灵！祝你进步！”
      尊敬的贺普超教授永垂不朽！

Ten Simple Rules for Getting Grants

Philip E. Bourne^*, Leo M. Chalupa

Philip E. Bourne is a professor in the Department of Pharmacology, University of California San Diego, La Jolla, California, United States of America, and is Editor-in-Chief of PLoS Computational Biology. Leo M. Chalupa is a professor and chair in the Section of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University of California Davis, Davis, California, United States of America.

Published: February 24, 2006

DOI: 10.1371/journal.pcbi.0020012

Copyright: © 2006 Bourne and Chalupa. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Citation: Bourne PE, Chalupa LM (2006) Ten Simple Rules for Getting Grants. PLoS Comput Biol 2(2): e12

* To whom correspondence should be addressed. E-mail: bourne@sdsc.edu

This piece follows an earlier Editorial, “Ten Simple Rules for Getting Published” [1], which has generated significant interest, is well read, and continues to generae a variety of positive comments. That Editorial was aimed at students in the early stages of a life of scientific paper writing. This interest has prompted us to try to help scientists in making the next academic career step—becoming a young principal investigator. Leo Chalupa has joined us in putting together ten simple rules for getting grants, based on our many collective years of writing both successful and unsuccessful grants. While our grant writing efforts have been aimed mainly at United States government funding agencies, we believe the rules presented here are generic, transcending funding institutions and national boundaries.

At the present time, US funding is frequently below 10% for a given grant program. Today, more than ever, we need all the help we can get in writing successful grant proposals. We hope you find these rules useful in reaching your research career goals.

Rule 1: Be Novel, but Not Too Novel

Good science begins with new and fresh ideas. The grant writing process should be a pleasure (no, we are not kidding), for it allows you to articulate those ideas to peers who have to read your grants but not necessarily your papers. Look at grant writing as an opportunity to have an impact. Feel passionate about what you are writing—if you are not passionate about the work, it is probably not a good grant and is unlikely to get funded. “Me-too” science will not get funded when funding levels are low. On the other hand, science that is too speculative will not be supported either, particularly when funds are tight—sad but true.

Rule 2: Include the Appropriate Background and Preliminary Data as Required

You need to convince reviewers that the work you propose needs to be done and that you are the best person to do it. Different granting programs require differing amounts of preliminary data. For certain programs, it can be said that the work must be essentially done before the grant is awarded, and that the funds are then used for the next phase of the research program. There is some truth in this. So where appropriate, do provide some tantalizing preliminary result, making sure to tell the reviewers what these results imply with respect to the specific aims of your proposal. In formulating the motivation for your proposal, make sure to cite all relevant work—there is nothing worse than not appropriately citing the work of a reviewer! Finally, convince the reviewer that you have the technical and scientific background to perform the work as proposed.

Rule 3: Find the Appropriate Funding Mechanism, Read the Associated Request for Applications Very Carefully, and Respond Specifically to the Request

Most funding organizations have specific staff to assist in finding funding opportunities, and most funding agencies have components of their Web sites designed to help investigators find the appropriate programs. Remember, programs want to give away money—the jobs of the program's staff depend on it. The program staff can help you identify the best opportunities. If your grant does not fit a particular program, save your time and energy, and apply elsewhere, where there is a better programmatic fit.

Rule 4: Follow the Guidelines for Submission Very Carefully and Comply

Many funding bodies will immediately triage grants that do not comply with the guidelines—it saves the program time and money. This extends to all the onerous supporting material—budget justification, bibliographies, etc. Get them right and keep them updated for future applications. Even if it goes to review, an inappropriately formulated application may aggravate the reviewers, and will have a negative impact even if the science is sound. Length and format are the most frequent offenders.

Rule 5: Obey the Three Cs—Concise, Clear, and Complete

The grant does not have to fill the allotted page count. Your goal should be to provide a complete reckoning of what is to be done, as briefly as possible. Do not rely on supplements (which may not be allowed) or on Web sites (review may be actively discouraged since it has the potential to compromise anonymity). Specify the scope up-front and make sure it is realistic with respect to the funds requested. A common temptation for inexperienced grant writers is to propose to do too much. Such applications are usually judged as overly ambitious and consequently poorly rated.

Rule 6: Remember, Reviewers Are People, Too

Typically, reviewers will have a large number of grants to review in a short period. They will easily lose concentration and miss key points of your proposal if these are buried in an overly lengthy or difficult-to-read document. Also, more than likely, not all the reviewers will be experts in your discipline. It is a skill to capture the interest of experts and nonexperts alike. Develop that skill. Unlike a paper, a grant provides more opportunity to apply literary skills. Historical perspectives, human interest, and humor can all be used judiciously in grants to good effect. Use formatting tricks (without disobeying rule 4), for example, underlining, bolding, etc., and restate your key points as appropriate. Each section can start with a summary of the key points.

Rule 7: Timing and Internal Review Are Important

Give yourself the appropriate lead time. We all have different approaches to deadlines. Ideally, you should complete a draft, leave sufficient time to get feedback from colleagues, and then look at the grant again yourself with a fresh eye. Having a spectrum of scientific colleagues who are similar to the likely reviewer pool critique your grant is very valuable.

Rule 8: Know Your Grant Administrator at the Institution Funding Your Grant

At the end of the day, this person is your best advocate. How well you understand each other can make a difference. Many grant administrators have some measure (limited to complete) discretionary control over what they fund. The more they know and understand you and your work, the better your chances of success. Do not rely just on E-mail to get to know the grant administrator. Do not be intimidated. Talk to them on the telephone and at meetings where possible—they want to help.

Rule 9: Become a Grant Reviewer Early in Your Career

Being on review panels will help you write better grants. Understanding why grants get triaged before complete review, how a panel reacts to a grant, what the discretionary role of program officers is, and what the role of oversight councils is provide valuable lessons for writing successful grants of your own and for giving others advice about this process.

Rule 10: Accept Rejection and Deal with It Appropriately

Rejection is inevitable, even for very good grants when funding levels are low. Learn to live with rejection and to respond appropriately. Do not be defensive; address each criticism head on and respond with facts and not emotional arguments. When resubmission is necessary, make it very clear to the reviewer that you understand what was wrong the first time. Indicate precisely how you have fixed the problems. In the resubmitted application, never argue with the validity of the prior review. If the grant was close to being funded the first time around, remind the reviewers of that fact by including the previous score if appropriate, and make it crystal clear why this version is much improved.

There are no previously unrevealed secrets to grant writing presented here. Rather, it is a concise picture intended to help our early career readers take the next step. If you feel like you need more detail, take a look at Kraicer's article [2]. Good luck on getting those grants.

References

1.    Bourne PE (2005) Ten simple rules for getting published. PLoS Comput Biol 1: e57. DOI: 10.1371/journal.pcbi.0010057.

2.    Kraicer J (1997) The art of grantmanship. Strasbourg: Human Frontier Science Program. Available: http://www.hfsp.org/how/ArtOfGrants.htm. Accessed 19 January 2006.

Ten Simple Rules for Getting Published

Philip E. Bourne

Published: October 28, 2005

DOI: 10.1371/journal.pcbi.0010057

Copyright: © 2005 Philip E. Bourne. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are properly credited.

Citation: Bourne PE (2005) Ten Simple Rules for Getting Published . PLoS Comput Biol 1(5): e57

Philip E. Bourne is Editor-in-Chief of PLoS Computational Biology. E-mail: bourne@sdsc.edu

The student council (http://www.iscbsc.org/) of the International Society for Computational Biology asked me to present my thoughts on getting published in the field of computational biology at the Intelligent Systems in Molecular Biology conference held in Detroit in late June of 2005. Close to 200 bright young souls (and a few not so young) crammed into a small room for what proved to be a wonderful interchange among a group of whom approximately one-half had yet to publish their first paper. The advce I gave that day I have modified and present as ten rules for getting published.

Rule 1: Read many papers, and learn from both the good and the bad work of others.

It is never too early to become a critic. Journal clubs, where you critique a paper as a group, are excellent for having this kind of dialogue. Reading at least two papers a day in detail (not just in your area of research) and thinking about their quality will also help. Being well read has another potential major benefit—it facilitates a more objective view of one's own work. It is too easy after many late nights spent in front of a computer screen and/or laboratory bench to convince yourself that your work is the best invention since sliced bread. More than likely it is not, and your mentor is prone to falling into the same trap, hence rule 2.

Rule 2: The more objective you can be about your work, the better that work will ultimately become.

Alas, some scientists will never be objective about their own work, and will never make the best scientists—learn objectivity early, the editors and reviewers have.

Rule 3: Good editors and reviewers will be objective about your work.

The quality of the editorial board is an early indicator of the review process. Look at the masthead of the journal in which you plan to publish. Outstanding editors demand and get outstanding reviews. Put your energy into improving the quality of the manuscript before submission. Ideally, the reviews will improve your paper. But they will not get to imparting that advice if there are fundamental flaws.

Rule 4: If you do not write well in the English language, take lessons early; it will be invaluable later.

This is not just about grammar, but more importantly comprehension. The best papers are those in which complex ideas are expressed in a way that those who are less than immersed in the field can understand. Have you noticed that the most renowned scientists often give the most logical and simply stated yet stimulating lectures? This extends to their written work as well. Note that writing clearly is valuable, even if your ultimate career does not hinge on producing good scientific papers in English language journals. Submitted papers that are not clearly written in good English, unless the science is truly outstanding, are often rejected or at best slow to publish since they require extensive copyediting.

Rule 5: Learn to live with rejection.

A failure to be objective can make rejection harder to take, and you will be rejected. Scientific careers are full of rejection, even for the best scientists. The correct response to a paper being rejected or requiring major revision is to listen to the reviewers and respond in an objective, not subjective, manner. Reviews reflect how your paper is being judged—learn to live with it. If reviewers are unanimous about the poor quality of the paper, move on—in virtually all cases, they are right. If they request a major revision, do it and address every point they raise both in your cover letter and through obvious revisions to the text. Multiple rounds of revision are painful for all those concerned and slow the publishing process.

Rule 6: The ingredients of good science are obvious—novelty of research topic, comprehensive coverage of the relevant literature, good data, good analysis including strong statistical support, and a thought-provoking discussion. The ingredients of good science reporting are obvious—good organization, the appropriate use of tables and figures, the right length, writing to the intended audience—do not ignore the obvious.

Be objective about these ingredients when you review the first draft, and do not rely on your mentor. Get a candid opinion by having the paper read by colleagues without a vested interest in the work, including those not directly involved in the topic area.

Rule 7: Start writing the paper the day you have the idea of what questions to pursue.

Some would argue that this places too much emphasis on publishing, but it could also be argued that it helps define scope and facilitates hypothesis-driven science. The temptation of novice authors is to try to include everything they know in a paper. Your thesis is/was your kitchen sink. Your papers should be concise, and impart as much information as possible in the least number of words. Be familiar with the guide to authors and follow it, the editors and reviewers do. Maintain a good bibliographic database as you go, and read the papers in it.

Rule 8: Become a reviewer early in your career.

Reviewing other papers will help you write better papers. To start, work with your mentors; have them give you papers they are reviewing and do the first cut at the review (most mentors will be happy to do this). Then, go through the final review that gets sent in by your mentor, and where allowed, as is true of this journal, look at the reviews others have written. This will provide an important perspective on the quality of your reviews and, hopefully, allow you to see your own work in a more objective way. You will also come to understand the review process and the quality of reviews, which is an important ingredient in deciding where to send your paper.

Rule 9: Decide early on where to try to publish your paper.

This will define the form and level of detail and assumed novelty of the work you are doing. Many journals have a presubmission enquiry system available—use it. Even before the paper is written, get a sense of the novelty of the work, and whether a specific journal will be interested.

Rule 10: Quality is everything.

It is better to publish one paper in a quality journal than multiple papers in lesser journals. Increasingly, it is harder to hide the impact of your papers; tools like Google Scholar and the ISI Web of Science are being used by tenure committees and employers to define metrics for the quality of your work. It used to be that just the journal name was used as a metric. In the digital world, everyone knows if a paper has little impact. Try to publish in journals that have high impact factors; chances are your paper will have high impact, too, if accepted.

When you are long gone, your scientific legacy is, in large part, the literature you left behind and the impact it represents. I hope these ten simple rules can help you leave behind something future generations of scientists will admire.

要点：

1. 多阅读论文，从好的和不好的文章中学习写作；
2. 对自己的工作认识越客观，对发表论文越有利；
3. 坚持一点：好的主编和审稿人对你的工作是客观的；（他们的话是对的，有点像足球场上的裁判）
4. 如果你的英文不好，尽早学习；事后再改，于事无补；
5. 学着适应被拒绝；
6. 好的科学工作是由以下要素组成：新颖的研究主题，丰富的相关文献，漂亮的实验数据，严谨的数据分析（强有力的统计分析支持）和深入的结果讨论。
好的研究报告是由以下要素组成：良好的组织，适当的图表，恰当的长度；
7. 开始写作时你就应该清楚你要解决的问题是什么；
8. 如果可能，做审稿人对你是有帮助的；
9. 尽早决定投哪个期刊；
10. 质量就是一切；把你的文章投到好的期刊，而不是分成篇投到差的期刊。

寿山石：“五子做寿图”